【血液样本采集抗凝剂选择】
1.乙二胺四乙酸(EDTA)盐：常用其钠盐或钾盐，能与血液中钙离子结合成螯合物，而使Ca2+失去凝血作用，从而阻止血液凝固。EDTA盐对血细胞形态和血小板计数影响很小，适用于多项血液学检查。但EDTA影响血小板聚集，不适合于作凝血象检查和血小板功能试验。
2.草酸盐：常用的有草酸钠、草酸钾和草酸铵，它们溶解后解离的草酸根与标本中的钙离子形成草酸钙沉淀，使Ca2+失去凝血功能。草酸钠通常用0.1mol/L浓度，与血液按1：9比例使用，过去主要用于凝血象检查。但草酸盐对凝血V因子保护功能差，影响凝血酶原时间测定效果;草酸盐与钙结合形成的沉淀物，影响自动凝血仪的使用。因此，凝血象检查宜选用枸橼酸钠为抗凝剂。
3.肝素：肝素是生理性抗凝剂，广泛存在于肺、肝、脾等几乎所有组织和血管周围肥大细胞和嗜碱性粒细胞的颗粒中。其抗凝机制较为复杂，主要是加强抗凝血酶Ⅲ灭活丝氨酸蛋白酶的作用，从而阻止凝血酶的形成，并有阻止血小板聚集等多种抗凝作用。肝素具有抗凝力强、不影响血细胞体积、不易溶血等优点。除有些因素会干扰凝血机制检查项目外，绝大多数的检查都可用肝素作为抗凝剂，它是红细胞透渗脆性试验理想的抗凝剂。尽管肝素可以保持红细胞的自然形态，但由于其常可引起白细胞聚集，并使血涂片在罗氏染色时产生蓝色背景，因此肝素抗凝血不适合血液学一般检查。
4.枸橼酸盐：主要为枸橼酸钠，凝血试验时枸橼酸盐能与血液中的钙离子结合形成螯合物，从而阻止血液凝固。枸橼酸钠与血液的比例为1∶9.枸橼酸盐在血中的溶解度低，抗凝力不如前几种抗凝剂。多用于临床血液学检查，一般用于红细胞沉降率和凝血功能测定。因其毒性小，也是输血保养液的成分之一。
【载玻片的清洗】
1.洗洁精加入清水若干，100℃，30min。
2.软布沾洗洁净液洗刷玻片，不留死角。
3.自来水冲洗玻片，并晾干。
4.0.2%HCI液浸泡，≥4小时。
5.自来水冲洗玻片。
6.过蒸馏水3遍。
7.摆在架上自然晾干。
8.浸泡95%酒精。
9.摆在架上自然晾干。
10.冻存与-20℃，≥2小时，备用。
【血涂片的制备步骤】
1.采血
静脉采血后，使用玻璃棒、毛细管、注射针头等在距载玻片一端1cm处加1滴抗凝血。
2.推片
左手平执载玻片，或放在类似桌子等平坦地方，右手持推片从前方接近血滴，使血液沿推片边缘展开成适当的宽度，立即将推片与载玻片呈30~45°角，轻压推片边缘将血液推制成厚薄适宜的血涂片，血涂片应呈舌状，头、体、尾清晰可见。
3.干燥
将推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。天气寒冷或潮湿时，应于37℃温箱中保温促干，以免细胞变形缩小。
4.标记
在载玻片的一端用记号笔编号。
5.染色
用特种玻璃铅笔在血膜两侧画两条线，防止染液外溢。再将瑞氏染液滴在血膜上，至染液淹没全部血膜，染1分钟。加等量蒸馏水(或缓冲液)与染液混合再染5分钟。最后用蒸馏水把染液冲掉，用吸水纸吸干，自然干燥后，即可观察。
【瑞氏染色法染液的配制】
1.瑞氏染液配制：
瑞氏染料830gm或1g
甲醇(AR)500ml或600ml
先称干燥(事先放入温箱干燥过夜)瑞氏染料放置乳钵内，用乳棒轻轻敲碎染料成粉末，再行研磨至听不到研芝麻声即呈细粉末，加少许甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳缸内显“一面镜”光泽，而无染料粉粒沉着，再加较多量甲醇研磨呈一面镜光亮，静置片刻，将上层液体倒入一清洁储存瓶内(最好用甲醇空瓶)，再加甲醇研磨，重复数次，直至乳钵内染料及甲醇用完为止，摇匀，密封瓶口，存室温暗处，储存愈久，则染料溶解、分解就越好，一般储存3个月以上为佳。
2.缓冲液：
(1)缓冲液作用：染色对氢离子浓度是十分敏感的，据观察pH值的改变，可使蛋白质与染料形成的化合物重新离解。缓冲液须保持一定的pH使染色稳定，PBS的pH一般在6.4~6.8，偏碱性染料可与缓冲液中酸基起中和作用，偏酸性染料则与缓冲液中的碱基起中和作用，使pH恒定。
(2)缓冲液配制(pH6.4~6.8，弱酸性)：
配方1：1%KH2PO430mlM/15KH2PO473.5ml
配方2：1%Na2HPO420mlM/15Na2HPO426.5ml
H2O(新鲜)加至1000ml
置室温黑暗处，瓶口密封，防止霉菌污染，如有污染则应报废。
【瑞氏染色法的基本步骤】
1.滴加瑞氏吉姆萨A液(约0.5ml-0.8ml)涂片上，并让染液覆盖整个标本染色1min;
2.再将瑞氏吉姆萨B液加于A液上面(滴加量为A液的2-3倍)，以嘴或洗耳球吹出微风使液面产生涟漪状，使两液充分混合，染色3-10min.(染血片时间可略短，染骨髓片时间应视细胞量多少而异)
3.水洗(冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲去，以防有沉渣沉淀在标本上)，干燥、镜检。
【瑞氏染色法操作时的注意事项】
1.染色时间须视何种标本，涂片厚度，有核细胞多少，何种细胞及室温等而定;通常染血液涂片时滴加B液后染2-4分钟，染骨髓片则应不少于8分钟;气温较低时，可适当延长染色时间。染色结果如出现嗜酸性粒细胞变碱，则考虑是否染色时间太长所致。
2.做骨髓涂片时，因为骨髓纤维蛋白含量较高，凝固较快，所以涂片过程要快。骨髓不可用草酸盐抗凝，否则会使血细胞核变形，核染色质致密，胞浆空泡形成，出现草酸盐结晶。
3.染液量需充足，勿使染液蒸发干燥，以防染料沉着于涂片上。
4.做细胞染色时，当天气寒冷或湿度较大时，应于37℃温箱中保温促干，以免细胞变形缩小或在染色时脱片。
5.染料放置时间越长，染色效果越好。
6.本试剂应由专业人员使用。
血细胞染色—吉姆萨染色法
吉姆萨(Giemsa)染色法吉姆萨染液由天青，伊红组成。染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质;细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质;中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。
PH对细胞染色有一些影响。细胞里各种成分均不蛋白质，因为蛋白质系两性电解质，带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境里正电荷增多，易和伊红结合，染色为偏红;在偏碱性环境里负电荷增多，易和美蓝或天青结合，染色偏蓝。所以细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片一定清洁，要无酸碱污染。配制顼特液一定用优质甲醇，稀释染色一定用缓冲液，冲洗一定用水应近中性，不然可导致各种细胞染色反应异常，以致于识别困难，甚至造成错误的。
一般性操作技术血涂片制备;细胞染色;显微检查;血液病诊断;染色不良。
